Одной из технологий, которая помогает анализировать разнообразие бактерий, является одноклеточная транскриптомика. Он использует небольшие молекулы-мессенджеры (мРНК) для определения того, какие гены активны в отдельных бактериальных клетках популяции в определенный момент времени. Даже в сложных группах бактерий анализ мРНК показывает, как отдельные бактериальные клетки реагируют на антибиотики или другие изменения окружающей среды.

Публикация в журнале "Nature Protocols"

Исследователи из Университета Юлиуса-Максимилиана (JMU) Вюрцбурга и Института Гельмгольца по исследованию инфекций на основе РНК (HIRI) в Вюрцбурге разработали инновационный вариант бактериальной одноклеточной транскриптомики в 2020 году. Этот метод называется бактериальным MATQ-seq и имеет ряд преимуществ.

С тех пор исследователи из Вюрцбурга еще больше усовершенствовали свой метод. В журнале Nature Protocols они теперь представляют пошаговый протокол, то есть точные инструкции по созданию одиночных бактериальных транскриптомов с помощью MATQ-seq. Протокол также включает экспериментальный и компьютерный анализ полученных данных.

Протокол охватывает 95 процентов используемых бактерий

"Мы разработали надежный бактериальный протокол scRNA-seq, основанный на количественном секвенировании одноклеточной РНК", - говорит доктор Кристина Хомбергер из Института молекулярной биологии инфекций JMU, которая в настоящее время является исследователем в Биоцентре Базельского университета. Ученый и ее коллега по JMU доктор Фабиан Имдал являются первыми авторами исследования.

"Используя модельные организмы, такие как Salmonella enterica, мы показываем, что этот метод очень эффективен", - объясняет Кристина Хомбергер. При этом достигается очень высокий уровень удержания клеток - 95 процентов - это означает, что в конце процесса фактически создаются отдельные библиотеки генов из 95 процентов клеток, использованных в начале. Это значительно выше, чем в других протоколах, где уровень потерь достигает 70 процентов.

Анализируется активность от 300 до 600 генов

"Наш метод надежно определяет активность от 300 до 600 генов на бактериальную клетку. В среднем это также значительно больше, чем достигается в настоящее время другими методами", - говорит Фабиан Имдал. Основываясь на зарегистрированной активности генов, очень легко распознать, что в данный момент делает отдельная бактерия или к каким условиям окружающей среды она в данный момент адаптируется.

Вся процедура - от выделения отдельной ячейки до генерации необработанных данных - с помощью MATQ-seq занимает около пяти дней. Он идеально подходит для небольших образцов из сотен ячеек; в этом диапазоне он работает очень эффективно и с высоким разрешением. Для высокой пропускной способности клеток в диапазоне от сотен тысяч до миллионов клеток более подходят другие протоколы, в соответствии с которыми должны быть приняты высокие потери клеток и обнаружение менее 100 генов на клетку.

Уникальная во всем мире платформа для сотрудничества

"Наш протокол позволяет проводить надежный анализ различных видов бактерий, тем самым закладывая основу для разработки уникальной во всем мире платформы для секвенирования микробной одноклеточной РНК здесь, в Вюрцбурге", - объясняет профессор Йорг Фогель, директор HIRI и IMIB. Платформа направлена на объединение протоколов и экспертных знаний, что делает технологию доступной для других исследователей и лабораторий.

Новая платформа называется Center for Microbial Single-Cell RNA-seq (MICROSEQ): "Она основана на разработанной нами технологии и других признанных высокопроизводительных методах анализа транскриптома отдельных бактерий". В будущем исследовательские группы со всего мира смогут получить доступ к технологиям одноклеточной транскриптомики бактериальных клеток.