Значительный прогресс в области флуоресцентной микроскопии со сверхразрешением

  • Пользователь Алексей Коровин опубликовал
  • 17 марта 2023 г., 2:46:59 MSK
  • 0 комментариев
  • 49 просмотров
Доведение метода MINFLUX до более высокой пространственной и временной точности позволяет наблюдать динамику белка в физиологических условиях.

Ученые под руководством Нобелевского лауреата Стефана Хелла из Института медицинских исследований имени Макса Планка в Гейдельберге разработали микроскоп сверхразрешения с пространственно-временной точностью один нанометр в миллисекунду. Усовершенствованная версия недавно представленной ими микроскопии MINFLUX со сверхразрешением позволила наблюдать крошечные движения отдельных белков с беспрецедентным уровнем детализации: шаговое движение моторного белка кинезина-1, когда он движется по микротрубочкам, потребляя АТФ. Работа подчеркивает мощь MINFLUX как революционно нового инструмента для наблюдения за конформационными изменениями в белках нанометрового размера.

Разгадка внутренней работы клетки требует знания биохимии отдельных белков. Измерение крошечных изменений в их положении и форме является здесь главной задачей. Флуоресцентная микроскопия, в частности микроскопия со сверхразрешением (т.е. наноскопия), стала незаменимой в этой развивающейся области. MINFLUX, недавно представленная система флуоресцентной наноскопии, уже достигла пространственного разрешения от одного до нескольких нанометров: размера небольших органических молекул. Но для того, чтобы вывести наше понимание молекулярно-клеточной физиологии на новый уровень, требуются наблюдения с еще более высоким пространственно-временным разрешением.

Когда группа Стефана Хелла впервые представила MINFLUX в 2016 году, он использовался для отслеживания флуоресцентно меченых белков в клетках. Однако эти перемещения были случайными, и отслеживание имело точность порядка десятков нанометров. Их исследование является первым, в котором разрешающая способность MINFLUX применяется к конформационным изменениям белков, в частности моторного белка кинезина-1. Чтобы сделать это, исследователи из Института медицинских исследований Макса Планка разработали новую версию MINFLUX для отслеживания одиночных флуоресцентных молекул.

Все общепринятые методы измерения динамики белка имеют серьезные ограничения, препятствующие их способности охватывать критически важный (суб) нанометровый / (суб)миллисекундный диапазон. Некоторые обеспечивают высокое пространственное разрешение, вплоть до нескольких нанометров, но не могут достаточно быстро отслеживать изменения. Другие имеют высокое временное разрешение, но требуют маркировки шариками, которые на 2-3 порядка больше, чем исследуемый белок. Поскольку функционирование белка, вероятно, будет нарушено гранулами такого размера, исследования с использованием гранул оставляют открытыми вопросы.

Флуоресценция от одной молекулы

MINFLUX, однако, требует только стандартной флуоресцентной молекулы размером 1 нм в качестве метки, прикрепленной к белку, и поэтому может обеспечить как разрешение, так и минимальную инвазивность, которые необходимы при изучении динамики нативного белка. "Одна из задач заключается в создании микроскопа MINFLUX, который работает близко к теоретическому пределу и защищен от шума окружающей среды", - говорит Отто Вольфф, аспирант группы. "Разработка зондов, которые не влияют на функцию белка, но все же раскрывают биологический механизм, - это другое", - добавляет его коллега Лукас Шейдерер.

Микроскоп MINFLUX, который сейчас внедряют исследователи, может регистрировать движения белка с пространственно-временной точностью до 1,7 нанометра в миллисекунду. Для этого требуется обнаружить всего около 20 фотонов, испускаемых флуоресцентной молекулой. "Я думаю, мы открываем новую главу в изучении динамики отдельных белков и того, как они меняют форму в процессе своего функционирования", - говорит Стефан Хелл. "Сочетание высокого пространственного и временного разрешения, обеспечиваемое MINFLUX, позволит исследователям изучать биомолекулы так, как никогда прежде".

Разрешение ступенчатого движения кинезина-1 с помощью АТФ в физиологических условиях

Кинезин-1 является ключевым игроком в транспортировке груза по нашим клеткам, и мутации этого белка лежат в основе нескольких заболеваний. Кинезин-1 на самом деле "гуляет" по нитям (микротрубочкам), которые охватывают наши клетки подобно сети улиц. Можно представить себе это движение буквально как "шагание", поскольку белок имеет две "головки", которые попеременно меняют свое местоположение на микротрубочке. Это движение обычно происходит вдоль одной из 13 протофиламентов, образующих микротрубочку, и подпитывается расщеплением основного поставщика энергии клетки АТФ (аденозинтрифосфата).

Используя только один флуорофор для маркировки кинезина-1, ученые записали регулярные 16-нм. шаги отдельных головок, а также 8-нм подшагов с пространственно-временным разрешением нанометр/миллисекунда. Их результаты доказали, что АТФ поглощается, когда одна головка связана с микротрубочкой, но что гидролиз АТФ происходит, когда связаны обе головки. Это также показало, что шагание включает в себя вращение белковой "ножки", части молекулы кинезина, которая удерживает груз. Пространственно-временное разрешение MINFLUX также выявило вращение головы в начальной фазе каждого шага. Примечательно, что эти результаты были сделаны с использованием физиологических концентраций АТФ, что до сих пор было невозможно с помощью крошечных флуоресцентных меток.

Будущий потенциал в изучении динамики белка

"Я взволнован, так что посмотрим, куда приведет нас MINFLUX. Это добавляет еще одно измерение к изучению того, как работают белки. Это может помочь нам понять механизмы, лежащие в основе многих заболеваний, и в конечном итоге внести свой вклад в разработку методов лечения", - добавляет Джессика Маттиас, ученый-постдокторант, ранее работавшая в Hell's group, которая сейчас изучает применение MINFLUX для решения различных биологических вопросов.

Комментарии

0 комментариев